15 16 maggio 2012 sfoglia numero

Biotecnologie

Le biotecnologie proteggono le origini

Riccardo Beretta
Luca Masotto
Raffinate tecniche biotecnologiche per la tutela dei prodotti lattiero-caseari a denominazione di origine.

Il 15 febbraio scorso il Parlamento europeo ha approvato definitivamente la modifica dell’Organizzazione comune di mercato contenente un pacchetto di misure e strumenti per il settore lattiero-caseario. Tra le novità introdotte, il “pacchetto latte” ha rafforzato il ruolo delle organizzazioni dei produttori e ha aperto la strada alla programmazione produttiva da parte dei Consorzi di tutela dei prodotti a denominazione di origine. Questi ultimi potranno così regolare le produzioni in funzione della domanda, mantenendo stabili le quotazioni all’origine e i prezzi al consumo.
Quindici giorni prima, Ismea aveva presentato alla stampa il rapporto Qualivita 2011 nel quale viene evidenziata l’importanza economica dei prodotti a denominazione di origine anche in momenti congiunturali difficili come quello in corso. Il valore all’origine delle produzioni certificate italiane è di circa 6 miliardi di euro (10 miliardi al consumo). In particolare, i primi due formaggi (grana padano e parmigiano reggiano) costituiscono, da soli, il 40% circa del fatturato complessivo dei 239 prodotti a denominazione. Si tratta di numeri importanti, soprattutto perché sono prodotti diffusi, riconoscibili e apprezzati a livello globale. Non a caso sono frequenti i tentativi di frodi alimentari che li vedono protagonisti insieme ad altri prodotti tradizionali quali – per citare i più “imitati” – la mozzarella di bufala campana, il gorgonzola e il pecorino romano.
La difesa dei prodotti a denominazione non riveste un’importanza meramente economica, ma anche sociale dal momento che la filiera coinvolge 85mila aziende su tutto il territorio nazionale. In un mercato globalizzato – le esportazioni annuali di formaggi italiani valgono oltre 1.100 milioni di euro – la verifica dell’autenticità delle produzioni di qualità non può essere affidata ai soli meccanismi di tracciabilità/rintracciabilità, ma deve avere il supporto di tecnologie d’avanguardia, capaci di discriminare i prodotti a marchio da quelli generici. Una di queste è la spettrometria di massa.

La spettrometria di massa
Chiunque abbia visto almeno una delle numerose serie televisive americane di crime science che inondano i nostri teleschermi conosce la spettrometria di massa. Una macchina analizza il campione prelevato dalla polizia scientifica e, in pochi secondi, restituisce l’esatta composizione della sostanza sotto forma di un grafico simile a un elettrocardiogramma molto irregolare. Si tratta, ovviamente, di telefilm che semplificano la complessità di uno strumento sofisticato come lo spettrometro di massa il quale, per poter restituire risultati attendibili, ha bisogno dell'insostituibile apporto del fattore umano.
La spettrometria di massa si basa sulla ionizzazione di campioni da analizzare che sono successivamente separati in base al rapporto massa/carica. Ogni spettrometro di massa restituisce uno spettro con tutte le molecole presenti nel campione, caratterizzate da un determinato rapporto massa/carica. Nata nel settore chimico, questa tecnica comincia a essere utilizzata nello studio di biomolecole (proteine e peptidi) a partire dagli anni ‘80, dando un contributo decisivo alla proteomica.

La tecnologia Maldi-Tof
La spettrometria di massa Maldi-Tof consiste nel miscelare il campione da analizzare con una molecola (matrice) capace di assorbire le radiazioni UV e di formare cristalli. Successivamente i cristalli, colpiti da impulsi laser, portano alla ionizzazione della matrice, la quale, a sua volta, ionizza il campione. In altri termini, le molecole passano dallo stato solido allo stato gassoso ionizzato, attraverso un processo chiamato desorbimento. Una volta ionizzate, le molecole possono essere separate tramite un apposito analizzatore chiamato Time-of-flight (Tof).
Il Maldi-Tof si differenzia dalle altre strumentazioni di massa grazie alle seguenti caratteristiche:
•    pretrattamento del campione molto ridotto o assente,
possibilità di analizzare numerosi campioni (un target Maldi-Tof può ospitare contemporaneamente sino a 96 campioni),
•    elevata rapidità nell’esecuzione dell’analisi,
•    elevata sensibilità (nell’ordine delle picomoli o femtomoli ossia 10-12 o 10-15 moli).
La spettrometria di massa Maldi-Tof è in grado di fornire un fingerprint per ogni campione analizzato, ossia un profilo di peptidi e proteine del campione, ciascuno identificato da un valore di massa/carica. Il profilo ottenuto è caratteristico del campione e può essere utilizzato alla stregua di un’impronta digitale.

Potenzialità della tecnologia
La spettrometria Maldi-Tof è stata uno dei primi strumenti a disposizione delle biotecnologie. Tuttavia, la sua applicazione in campo alimentare è decisamente recente e tuttora in fase di affinamento.
In campo lattiero-caseario la spettrometria di massa Maldi-Tof ha dimostrato le proprie potenzialità nello studio della formazione di peptidi nel processo di stagionatura del formaggio: la proteolisi – soprattutto a carico della componente caseinica – è il principale responsabile dello sviluppo di aromi caratteristici dei formaggi. Il processo proteolitico può essere causato dall’azione di specifiche proteasi, provenienti dal tipo di caglio utilizzato o da colture microbiologiche utilizzati nella caseificazione.
A titolo esemplificativo si riporta uno studio di particolare interesse che ha riguardato alcuni formaggi con differenti caratteristiche di stagionatura e lavorazione tra i quali parmigiano reggiano e cheddar. I ricercatori si sono concentrati su una frazione del proteoma del formaggio al fine di ottenere spettri più “puliti” e meno complessi. In considerazione delle numerose variabili in gioco, per riuscire a discriminare questi formaggi non è stato possibile utilizzare un singolo marcatore. Pertanto, si è fatto ricorso all’aiuto della statistica, in particolare all’analisi multivariata, la quale permette di “confrontare” lo spettro di massa nella sua interezza, unendo l’informazione di tutti i segnali rilevati dallo spettrometro di massa. Affiancata dalla Maldi-Tof, l’analisi multivariata non solo è riuscita a discriminare i differenti campioni di formaggio, ma anche campioni dello stesso formaggio con differente grado di stagionatura o Paese di acquisto [1, 2, 3, 4, 5] come è possibile vedere nella figura, dove tra svariati campioni di formaggio, l’analisi multivariata associata alla spettrometria ha permesso di discriminare il parmigiano reggiano (in rosso) acquistato in Irlanda (PR-E) o in Italia (PR-I). Analogamente, ha permesso di distinguere campioni di cheddar (in verde) stagionati 1 giorno (CH-1) e 4 mesi (CH-4) [1]. Gli assi del grafico riportano la “vicinanza statistica” dei campioni.

Scovare le (vere) bufale…
Un’interessante applicazione di questa tecnologia consiste nel rilevare adulterazioni nella produzione di formaggi, tra i quali i più suscettibili a contraffazione sono chiaramente quelli a maggior valore aggiunto. Ad esempio, nel caso della mozzarella di bufala, l’adulterazione più comune consiste nell’aggiunta di latte bovino, circa tre volte più economico rispetto al latte di bufala. Vari gruppi di ricercatori, utilizzando la spettrometria di massa Maldi-Tof, sono riusciti a mettere a punto un metodo capace di scoprire l’utilizzo di latte bovino in campioni di latte di pecora o di bufala.
Questo è possibile grazie a due proteine del siero di latte chiamate alfa-lactoalbumina e beta-lactoglobulina: nei campioni di latte di bufala e pecora vi sono differenze nella sequenza aminoacidica rispetto alle corrispondenti proteine di latte bovino [6, 7].
Grafico analisi.jpg
























… e il (vero) provolone

Una variante della spettrometria di massa Maldi-Tof – la cosiddetta spettrometria Seldi-Tof di cui un esempio è riportato in figura – è stata recentemente utilizzata dal Consorzio di tutela del provolone valpadana. In questo caso lo scopo era tutelare il prodotto Dop, tenuto a seguire uno specifico disciplinare di produzione, rispetto ai provoloni generici.
Esempio di spettro.jpg






















In un blind test – ossia una prova in cui i ricercatori non conoscono l’origine dei prodotti da analizzare – eseguito su 10 campioni, la tecnologia Seldi-Tof è riuscita a discriminare correttamente l’80% dei campioni [8], un valore incoraggiante sebbene da migliorare.

L’avanguardia della tradizione
Le produzioni alimentari di qualità sono associate ai prodotti tipici dell’agricoltura italiana, prodotti tradizionali il cui disciplinare è stato tramandato da generazioni di agricoltori prima di essere codificato dai consorzi di tutela. Le biotecnologie sono invece conquiste decisamente più recenti e, forse per questo, l’opinione pubblica le considera ancora sinonimo di “scienza creatrice di organismi geneticamente modificati”. Si tratta di due mondi solo apparentemente opposti dall’interazione dei quali si ottengono risultati decisamente positivi.
L’utilizzo di tecnologie d’avanguardia come la spettrometria di massa Maldi-Tof consente di identificare numerose frodi alimentari con la conseguenza di tutelare il consumatore, valorizzare le produzioni di qualità e sostenere l’immagine del “mangiare italiano” nel mondo, dalla quale dipendono buona parte delle esportazioni agroalimentari nazionali. D’altra parte, anche nelle congiunture economiche meno favorevoli, la tenuta delle esportazioni dei prodotti a denominazione di origine è segno della necessità di puntare sulla qualità per segmentare il mercato dei prodotti agroalimentari e posizionarsi con forza sui mercati dei Paesi emergenti al fine di intercettare i consumi dei “nuovi ricchi”.

Riferimenti bibliografici
[1] Piraino P., 2007. Use of mass spectrometry to characterize proteolysis in cheese, Food chemistry, 101, pp. 964–972.
[2] Pripp A. H. et al., 1999. Multivariate statistical analysis of peptide profiles and free amino acids to evaluate effects of single-strain starters on proteolysis in miniature cheddar-type cheeses, International dairy journal, 9 (7), pp. 473–479.

[3] Pripp A. H. e al., 2000. Comparative study by multivariate statistical analysis of proteolysis in a sodium caseinate solution under cheese-like conditions caused by strains of Lactococccus, International dairy journal, 10(1–2), pp. 25–31.

[4] Pripp, A. H. et al., 2000. Chemometrical analysis of proteolytic profiles during cheese ripening, International dairy journal, 10 (4), pp. 249–253.

[5] Shakeel-Ur-Rehman et al., 1999. Assessing the proteolytic and cheese ripening properties of single strains of Lactococcus in miniature cheeses, Lait, 79 (4), pp. 361–383.

[6] Cozzolino R. et al., 2002. Identification of adulteration in water buffalo mozzarella and in ewe cheese by using whey proteins as biomarkers and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, Journal of mass spectrometry, 37, pp. 985–991.

[7] Cozzolino R. et al., 2001. Identification of adulteration in milk by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass Spectrometry, Journal of mass spectrometry, 36, pp. 1031–1037.

[8] Pisani V. E. et al., 2009. Valorizzazione e caratterizzazione del provolone valpadana mediante metodologie molecolari innovative, Presentazione del seminario tenuto presso la Camera di commercio, industria, artigianato e agricoltura di Torino il 16 giugno 2009
http://images.labto.camcom.it/f/seminari/Valorizzazione/Ce/Cerri.pdf

  Riccardo Beretta
biotecnologo, si occupa di biomarker discovery in campo agroalimentare e medico-farmaceutico presso il Parco tecnologico padano di Lodi


Luca Masotto
dottore agronomo, si occupa di verde urbano, consulenze tecniche ed estimative



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